分子相互作用的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）、免疫印跡（Western Blot）、熒光共振能量轉移（FRET）、高效液相色譜法(HPLC)等等，ELISA和WB雖然可用于檢測強親和力的相互作用，但不能分別反應結合和解離作用的強弱，而且檢測時(shí)間長(cháng)、通量低、操作步驟較多[1]?，F在主流的分子相互作用檢測的方法是表面等離子共振技術(shù)（Surface Plasmon Resonance，SPR）和生物膜層光學(xué)干涉（Bio-Layer Interferometry，BLI）。這兩種技術(shù)都是非標記技術(shù)，并都被美國藥典收錄（圖1），可作為蛋白質(zhì)、核酸、小分子等物質(zhì)的親和力檢測、動(dòng)力學(xué)參數檢測、結構表征和表位篩選。

圖1. SPR和BLI技術(shù)收錄在美國藥典中

原理介紹

兩種技術(shù)原理不同。SPR技術(shù)使用的光源是單波長(cháng)激光束，經(jīng)過(guò)棱鏡產(chǎn)生的多角度光線(xiàn)入射到金屬表面時(shí)，幾乎所有入射的光線(xiàn)都會(huì )被反射，但有一個(gè)特殊的角度的光線(xiàn)沒(méi)有被反射出來(lái)，而且光子的能量會(huì )被金屬吸收，進(jìn)而轉化成表面等離子體波，這個(gè)特殊的角度稱(chēng)為共振角[2]。由于等離子體波是在金屬表面進(jìn)行傳播的，分析物與金屬表面偶聯(lián)的配體蛋白發(fā)生相互作用后導致金屬膜表面折射率改變，進(jìn)而導致共振角發(fā)生改變[3]。實(shí)驗中，先將一種配體蛋白固定在金膜表面，然后將與之相互作用的分析物溶液流過(guò)芯片表面，隨著(zhù)流路中的分析物與金膜芯片上的配體蛋白發(fā)生結合解離作用，膜的厚度發(fā)生改變，膜表面折射率發(fā)生改變，共振角隨之改變。檢測器根據檢測到的變化繪制曲線(xiàn)，可得到生物分子之間相互作用的信號。

圖2. SPR技術(shù)原理

BLI是一種利用一次性光纖生物傳感器測量生物分子相互作用的光學(xué)技術(shù)。白光在BLI中沿著(zhù)生物傳感器引導到兩個(gè)界面：傳感器尖端的生物膜表面和內部參考層，光在兩層中的每一層都會(huì )反射至探測器，而這兩束反射光與入射光發(fā)生相長(cháng)干涉或相消干涉，這些干涉光波被光譜儀檢測到，并形成一幅干涉光譜，并在傳感器上報告為波長(cháng)的變化(位移Δλ，單位nm），這種位移直接反應出傳感器表面生物膜的厚度變化[4]。當生物傳感器的尖端浸入樣品時(shí)，分析物與傳感器表面的固定配體發(fā)生結合時(shí)，傳感器尖端的厚度增加，反射光的路徑長(cháng)度比之前更長(cháng)，使干涉光譜曲線(xiàn)向右產(chǎn)生位移；分析物和固定配體解離時(shí)，厚度減少，干涉光譜曲線(xiàn)向左位移[5]。這種位移經(jīng)檢測器監測后，以位移為縱坐標，以時(shí)間為橫坐標作圖，可為分子間相互作用提供準確、全面的動(dòng)力學(xué)數據。

圖3. BLI技術(shù)原理

用途：

兩種技術(shù)功能相似，最廣泛的用途是用于親和力檢測和動(dòng)力學(xué)分析，不僅能得到親和力常數，還能得到具體的結合、解離常數。根據待分析物的特性，選擇能與分析物發(fā)生相互作用的生物傳感器（不同的傳感器表面固定有不同的分子，如ProteinA、ProteinG、AHC、FAB2G、HIS1K、SA等），在液體系統中實(shí)時(shí)檢測出結合解離信號。常用于抗體Fc端的功能表征，例如和FcRγ蛋白、C1q和FcRn的親和力檢測；配體受體親和力分析等。

其次，可以用于含量檢測，實(shí)驗時(shí)利用不同濃度的標準品得到的不同信號繪制標準曲線(xiàn)，再將樣品檢測到的信號值帶入標準曲線(xiàn)，即可得到濃度值。這兩項技術(shù)還可以用于表位篩選，不同的抗體可以與相同的抗原結合，但結合表位不一定相同。表位鑒定中，針對同一個(gè)抗原的特異性抗體與一組中的所有抗體配對進(jìn)行測試，以評估它們是否競爭相同表位。

優(yōu)缺點(diǎn)比較：

SPR將樣品作為流體系統，而B(niǎo)LI技術(shù)是將傳感器浸入至樣品中，因此BLI技術(shù)樣品量少很多。SPR不能檢測高折射率樣品，如甘油，蔗糖、咪唑、DMSO等，但折射率的變化對BLI信號的影響很小，因此可以分析含有高折射率成分的溶液。BLI技術(shù)還可以檢測細胞裂解液或培養上清等粗樣品，因為只有與生物傳感器表面發(fā)生結合或解離的分子才會(huì )改變生物膜的厚度，周?chē)芤褐形唇Y合的分子不會(huì )影響干涉模式。同時(shí)，SPR需要大量的儀器維護，實(shí)驗結束后樣品不能回收，這增加了操作時(shí)間和成本。

但正因為SPR技術(shù)將樣品作為流路系統，因此它的分辨力和靈敏度優(yōu)于BLI。而且BLI技術(shù)溫控范圍有限，樣品是放在96孔板或384孔板中進(jìn)行檢測的，這面臨著(zhù)樣品蒸發(fā)的問(wèn)題。

總結：

總之，SPR和BLI技術(shù)作為分子相互作用分析的強大技術(shù)手段，現在應用越來(lái)越廣泛， SPR技術(shù)是實(shí)時(shí)檢測分子相互作用的“金標準”，已經(jīng)使用了大約二十年[6]，而B(niǎo)LI技術(shù)雖然使用較晚一些，但由于樣品使用量少、通量高、檢測快速、儀器使用方便、維護簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)成為全球增長(cháng)最快的非標記技術(shù)。

參考文獻：

[1]Pall Fortebio,Strategies Using Bio-Layer Interferometry Biosensor Technology for Vaccine Research and Development.Biosensors 2017, 7(4), 49; https://doi.org/10.3390/bios7040049.

[2]Andreea Olaru, Camelia BalaCrit,et al.Surface plasmon resonance (SPR) biosensors in pharmaceutical analysis.Rev Anal Chem. 2015;45(2):97-105. doi: 10.1080/10408347.2014.881250.

[3]Marek Piliarik , et al.Surface plasmon resonance biosensing.Methods Mol Biol. 2009:503:65-88. doi: 10.1007/978-1-60327-567-5_5.

[4]Sriram Kumaraswamy , Renee Tobias.Label-free kinetic analysis of an antibody-antigen interaction using biolayer interferometry.Methods Mol Biol. 2015:1278:165-82. doi: 10.1007/978-1-4939-2425-7_10.

[5]Apiyo, D.O. Biolayer Interferometry (Octet) for Label-free Biomolecular Interaction Sensing. In Handbook of Surface Plasmon Resonance, 2nd ed.; Schasfoort, R.B.M., Ed.; Royal Society of Chemistry: London, UK, 2017;pp. 356–397.

[6]Danlin Yang , Ajit Singh, et al.Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.J Vis Exp  (122); 2017.