酶聯(lián)免疫吸附測定法，即ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一門(mén)基于抗原抗體結合的技術(shù)，廣泛應用于血清、血漿、細胞上清液等檢測，發(fā)展至今已有50多年的歷史了，已經(jīng)滲透到各種科學(xué)研究中，成為生物醫藥研究不可或缺的經(jīng)典技術(shù)?；谄綍r(shí)進(jìn)行ELISA實(shí)驗時(shí)遇到的一些問(wèn)題，做了如下經(jīng)驗匯總：

Q   1、如何避免邊緣效應？

A   邊緣效應是指在實(shí)驗過(guò)程中，96孔板周?chē)着c中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同而產(chǎn)生的不均勻現象。ELISA實(shí)驗通常體現為邊緣孔的溫度較高，孔內液體揮發(fā)較快，導致邊緣孔的檢測OD值較中間孔偏高。減小邊緣效應的常用方法有：①將96孔板的周?chē)撞挥?，填充上?shí)驗buffer；②使用封板膜；③使用恒溫恒濕箱；④采用水浴加熱。

Q   2、ELISA實(shí)驗時(shí)，有必要進(jìn)行封閉嗎？

A   一般情況下，包被的抗原或抗體使用濃度較低，特別是抗體分子較大，包被后的酶標板表面存在未被占據的空隙。封閉就是讓不相關(guān)的蛋白質(zhì)填充這些空隙，從而避免后續步驟中加入的樣品結合到板子上產(chǎn)生非特異性吸附。常用的封閉試劑有BSA，脫脂牛奶和血清等。

Q   3、如何選擇合適的二抗？

A   在進(jìn)行ELISA方法優(yōu)化時(shí)，非常有必要嘗試多種抗體，包括多克隆與單克隆、不同的宿主物種、不同供應商的抗體。一般而言，單克隆抗體比多克隆抗體靈敏度高，特異性好，多克隆抗體批次間差異要大一些。同時(shí)，應確保二抗的種屬來(lái)源與包被抗原/抗體種屬來(lái)源不同。

在用眼一段時(shí)間后要注意休息，堅持做眼保健操,通過(guò)對眼部的按摩,能夠促進(jìn)局部血液循環(huán)。

Q   4、如何判斷四參數擬合時(shí)上平臺是否為真實(shí)的結合平臺？

A   使用酶標儀進(jìn)行讀數時(shí)，假如最高OD值達到3.5，并且出現了上平臺，這是否就是抗原抗體的結合平臺呢？這要看酶標儀本身的線(xiàn)性檢測范圍。例如，某酶標儀的檢測范圍是0-4 OD，而該儀器確保的線(xiàn)性檢測范圍是0-3 OD，一般需將檢測信號值的最高值控制在3OD左右。而實(shí)驗中的OD為3.5，實(shí)際是到了儀器檢測上限而非結合平臺，是假平臺。因此在進(jìn)行ELISA實(shí)驗時(shí)，不能為了得到一個(gè)完整的S曲線(xiàn)，而延長(cháng)顯色時(shí)間使OD值超過(guò)儀器線(xiàn)性檢測范圍。

Q   5、包被濃度如何控制？

A   包被濃度取決于實(shí)驗目的。通常在利用ELISA進(jìn)行定量實(shí)驗時(shí)，包被抗原的量要遠大于樣品的量，這樣才能抵消抗原抗體可逆反應帶來(lái)的影響。而進(jìn)行親和力分析時(shí)，包被抗原的濃度要遠小于抗體的濃度，這樣得到的曲線(xiàn)EC50值才能代表親和力常數KD。

Q   6、顯色時(shí)間如何控制？

A   顯色時(shí)間需控制在合理范圍內。顯色時(shí)間太短會(huì )導致檢測范圍太窄；顯色時(shí)間太長(cháng)會(huì )導致本底很高且靈敏度差?？梢酝ㄟ^(guò)預讀，判斷是否可以終止。采用TMB顯色時(shí)，可以不間斷的讀取波長(cháng)為370nm時(shí)的OD值，一般OD370nm為1.2時(shí)，終止后OD450nm大約為2.0。

Q   7、如何降低本底？

A   ①洗滌：可以在清洗液中添加吐溫或曲通 ，或增加洗滌次數；

     ②封閉：嘗試不同的封閉試劑、提高封閉液濃度或增加封閉時(shí)間；

     ③顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )增加本底，因此不能過(guò)度顯色；

     ④二抗濃度過(guò)高有可能增加本底，可采用棋盤(pán)法摸索出合適的酶聯(lián)抗體的濃度和包被濃度。

Q   8、ELISA法如何進(jìn)行抗原抗體親和力測定？還有別的替代方法嗎？

A   ELISA測定親和力時(shí)，需要滿(mǎn)足幾個(gè)條件：①首先需要有完整的四參數擬合S型曲線(xiàn)，即有平臺出現；②包被的抗原濃度要足夠??；③需要有合適的酶聯(lián)抗體濃度，酶聯(lián)抗體濃度過(guò)低可能會(huì )出現假平臺；④需要控制顯色時(shí)間，顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)超過(guò)酶標儀線(xiàn)性檢測范圍也可能導致假平臺。

但由于ELISA靈敏度限制，在一些親和力較弱的抗原抗體中，采用ELISA法得不到平臺，也就無(wú)法測得準確的親和力數值?？梢圆捎梅菢擞浻H和力測定法，目前常用的技術(shù)有生物膜層干涉 (BLI)和表面等離子共振 (SPR)，這兩個(gè)都是藥典認可的方法。