中華倉鼠卵巢細胞（CHO）做為生物藥物生產(chǎn)的重要工具，盡管目前表達量以達到g/L級別，但是高額的生產(chǎn)成本依然是生物藥品價(jià)格居高不下的重要原因之一。隨著(zhù)生物制藥以及CHO細胞的應用在醫藥行業(yè)所占比重日益增加，CHO細胞已成為各公司生產(chǎn)單克隆抗體及融合蛋白藥物的首選，因此細胞工程對CHO細胞的改造與優(yōu)化也變得極具意義?；蚓庉嫾夹g(shù)的迅速發(fā)展，為CHO細胞的改造與優(yōu)化也提供了良好的技術(shù)支持。
利用基因編輯技術(shù)，對CHO細胞基因組進(jìn)行編輯，進(jìn)行過(guò)表達，敲低或者敲除某個(gè)基因，影響CHO細胞的代謝，凋亡，轉錄等相關(guān)途徑，從而得到高產(chǎn)量的重組細胞株。進(jìn)行基因編輯行業(yè)內主要利用鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活樣效應因子核酸酶（TALEN）、歸巢核酸內切酶（Meganucleases）和成簇間隔短回文重復（CRISPR）4種基因組編輯技術(shù)來(lái)進(jìn)行CHO 細胞系的基因改造工作。
Sigma Aldrich 公司利用ZFNs分別將CHO細胞中的谷氨酰胺合成酶（GS）和二氫葉酸還原酶（DHFR）基因敲除，篩選出穩定的單克隆細胞系，用此改良后的細胞系生產(chǎn)生物藥品，增加了系統穩定性并提高了表達量，目前已作為市場(chǎng)上常被生物公司選擇的商業(yè)化銷(xiāo)售細胞株[1]。CHO細胞培養中病毒的污染對生物藥制品的安全性及市場(chǎng)化應用帶來(lái)嚴重的損害，小鼠細小病毒（MMV)侵染CHO細胞主要依賴(lài)于其病毒衣殼與CHO細胞表面的特定多糖相結合，而CHO細胞中的SLC35A1基因在這一過(guò)程中具有重要意義，SLC35A1負責將唾液酸運輸到高爾基體中。敲除該基因在細胞中的功能會(huì )產(chǎn)生唾液?；木厶墙Y構，從而消除了MVM與細胞結合并進(jìn)入細胞的能力。MilliporeSigma 在 CHOZN? GS-/- 細胞系基礎上進(jìn)行了敲除SLC35A1，得到了可以抵御MMV病毒的細胞株，并且細胞株的生長(cháng)以及產(chǎn)量并未得到影響[2][3]。TALENs技術(shù)作為ZFNs后的第二代基因編輯技術(shù)，目前應用在CHO細胞株改造案列并不多,Sakuma通過(guò)該技術(shù)將一段單鏈Fv-Fc基因成功靶向插入到了CHO細胞基因組內[4]。
目前表達抗體及蛋白主要使用懸浮細胞，但從ATCC得到的原始細胞株為貼壁細胞，因此需經(jīng)過(guò)多次馴化，才能得到無(wú)血清培養的懸浮細胞株，滿(mǎn)足工程細胞株高密度表達的目的。Namil Lee[5]通過(guò)鏈特異性RNA-seq策略獲得CHO細胞懸浮馴化過(guò)程中的轉錄組圖譜，發(fā)現在此過(guò)程中Igfbp4 和AqpI 基因下調，于是利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除CHO-K1細胞的這兩個(gè)基因，大大縮短了該細胞株的貼壁到懸浮的馴化時(shí)間，降低了藥物研發(fā)成本。Duncan McVey [6]等使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除TSC2基因，TSC2作為mTORC1的活性抑制劑，阻止mTORC1活性的降低有助于提高細胞的表達。敲除TSC2的細胞株，mTORC1活力上升，表型上細胞直徑變大，單細胞表達量提升2倍以上，并且TSC2的敲除并未影響到蛋白及抗體質(zhì)量。Salina Louie[7]通過(guò)該技術(shù)定向敲除CHO細胞中的FUT8基因（編碼一種α1，6巖藻糖基轉移酶），成功獲得了表達無(wú)巖藻糖基化單克隆抗體的工程細胞株。隨著(zhù)基因組學(xué)發(fā)展，對CHO細胞的基因組更加的了解，基因編輯定向改造CHO細胞也越來(lái)越方便。Grav利用多突變 CRISPR-Cas9技術(shù)在CHO-S細胞中敲除與細胞凋亡相關(guān)的FUT8、BAK和BAX基因，與野生型CHO-S 細胞相比，敲除型細胞系顯示出更好的抗凋亡能力，在Rituximab藥物生產(chǎn)中，抑制細胞凋亡，增加了培養時(shí)間，使目的蛋白提高了187倍[8]。Wilkens在CHO細胞中敲除LDHA，在細胞發(fā)酵時(shí)防止乳酸積累，從而抑制細胞凋亡，也在Fc融合蛋白中得到應用，使蛋白產(chǎn)量增高2.8倍[9]。Ley 在CHO-S細胞中敲除代謝相關(guān)基因HPD, GAD2，也達到了防止乳酸積累，抑制細胞凋亡的作用[10]。Xiong在CHO-S利用CRISPR干擾技術(shù)敲除BAK, BAX, 和CASP3基因，也可抑制細胞凋亡[11]。Miao 在CHO-K1細胞中敲除BAK1基因抑制細胞凋亡[12]，在CHO-K1中敲除TSC2可增強環(huán)境適應力[13]，Jia 在CHO-K1中敲除DNMT3A可提高轉基因表達的穩定性[14]。Lu 在CHO-K1中敲除CYLD基因來(lái)抑制細胞凋亡，提高細胞生長(cháng)活力[15]。Wang 在CHO-K1中敲除hQSOX1和hSurvivin基因，增加代謝應激，從而誘導內質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白反應，防止UPR介導的細胞凋亡，也可提高細胞活率[16]。
CRISPR/Cas9技術(shù)作為近些年來(lái)新型基因編輯技術(shù)，深受科學(xué)家們的喜愛(ài)，利用該技術(shù)對CHO細胞工程株進(jìn)行改造，是一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟的方式。隨著(zhù)CRISPR技術(shù)的進(jìn)一步擴展，對基因操作的詳細控制變得更加容易，這對于生成更適合生物制藥生產(chǎn)的細胞非常重要。另外，伴隨著(zhù)基因組學(xué)發(fā)展，對CHO細胞代謝網(wǎng)絡(luò )的完善，也大大方便了CHO細胞工程的改造。
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