天然存在的大部分蛋白質(zhì)需要在表達后進(jìn)行復雜的翻譯后修飾，如糖基化，才可以發(fā)揮其正確的生物學(xué)功能。原核表達系統由于基因組簡(jiǎn)單，不能表達翻譯后修飾所需的酶。而真核表達系統可以進(jìn)行復雜的翻譯后修飾，可以表達分泌復雜的蛋白質(zhì)。真核表達系統包括酵母系統、昆蟲(chóng)桿狀病毒系統、植物細胞以及哺乳動(dòng)物細胞等類(lèi)型。真核表達系統的具體劃分見(jiàn)圖1。

圖1.真核表達系統

酵母表達系統代表性的類(lèi)型有釀酒酵母、甲醇酵母等。酵母表達系統具有原核表達系統和真核表達系統的優(yōu)點(diǎn)，具有翻譯后糖基化機制接近高等真核生物，易實(shí)現高密發(fā)酵，經(jīng)濟、快速、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)；其缺點(diǎn)是表達的蛋白質(zhì)糖基化與人源糖基化有較大差異，如甘露糖修飾比例高。一般用來(lái)表達細胞因子、小分子類(lèi)蛋白、酶類(lèi)等相關(guān)產(chǎn)品。酵母表達系統發(fā)酵密度高時(shí)，酵母的蛋白酶能夠降解表達的目的蛋白，引起目的蛋白C端或N端氨基酸降解，因此用于該系統生產(chǎn)的相關(guān)產(chǎn)品對于產(chǎn)品完整性的檢測至關(guān)重要。

1983年人類(lèi)首次構建桿狀病毒載體并成功表達了β-干擾素蛋白,此后,桿狀病毒表達載體(baculovirus expression vector, BEV)系統在生產(chǎn)重組病毒、表達重組蛋白、提高重組蛋白穩定性、產(chǎn)量及翻譯后修飾等方面不斷優(yōu)化,使得昆蟲(chóng)細胞-BEV系統成為四大常用表達系統之一^[1]。

目前已被廣泛應用到藥物研發(fā)，疫苗生產(chǎn)，重組病毒殺蟲(chóng)劑等領(lǐng)域。昆蟲(chóng)表達系統組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配，具有蛋白翻譯后的加工修飾；可同時(shí)在一個(gè)載體上表達多種蛋白，并且可容納大片段外源DNA而成為表達大片段DNA的理想載體。該病毒具有極好的安全性，外源基因插入多角體蛋白基因座位后將引起后者的缺失或失活，這樣重組病毒就不會(huì )形成多角體蛋白，使得病毒粒子缺少天然的保護物，故重組病毒在天然環(huán)境下極易失活，不會(huì )造成對人類(lèi)的危害和環(huán)境的污染^[2]。

與哺乳動(dòng)物細胞表達系統相比，昆蟲(chóng)桿狀病毒表達系統周期相對較短。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達系統載體的構建主要是針對桿狀病毒，而非昆蟲(chóng)細胞系本身，大大縮短了從基因克隆到蛋白表達的時(shí)間，目前Gibco ExpiSf 表達系統已研究出化學(xué)成分確定的培養基，并且開(kāi)發(fā)出快速制備蛋白的6-10周期的工藝流程，縮短了病毒擴增的過(guò)程。

以植物細胞作為轉化受體，不僅能把一些植物基因或DNA片段作為外源基因轉化到受體植物，而且能把動(dòng)物或微生物中存在的基因轉化并整合到植物基因組中，使其在植物細胞中表達。導入植物受體細胞轉化方法可分為直接基因轉移和間接基因轉移，直接基因轉移包括電激法、基因槍法、超聲波法、真空滲入法、PEG法、磷酸共沉淀法、微注射法、脂質(zhì)體介導法等；間接轉移法有農桿菌、病毒載體介導基因轉移，其中農桿菌轉化法在遺傳轉化中應用最為廣泛，一般轉化的目的基因包括各種抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑、保鮮、改善品質(zhì)等基因，用于農業(yè)及花色等方面的改善。

哺乳動(dòng)物細胞表達系統適合表達糖基化蛋白和空間結構較復雜的蛋白質(zhì)，表達產(chǎn)物一般存在于細胞質(zhì)中。但是通常在基因構建時(shí)在目的蛋白前加一段信號肽，使表達產(chǎn)物會(huì )分泌到細胞外。哺乳動(dòng)物細胞具有較好的翻譯后修飾系統，表達的蛋白生物學(xué)活性更加接近天然蛋白。常用的哺乳動(dòng)物細胞中，倉鼠細胞有CHO，BHK等，人類(lèi)細胞包含293、HT-1080、HuH-7等，老鼠細胞常用NS0和Sp2/0等，其中，CHO細胞表達體系已經(jīng)成為生物制藥最重要的表達系統。

CHO細胞，即中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell)。它最先開(kāi)始于1956年，美國科羅拉多大學(xué)Theodore T．Puck和同事Fa-Ten Kao通過(guò)一成年雌性中圍倉鼠卵巢中出了永生化的成纖維細胞CHO原始細胞系，1957年從原始細胞系的一個(gè)亞克隆得到了CHO-K1細胞系，這是一上皮貼壁生長(cháng)型細胞，培育方便。他們把CHO細胞免費供給需要的研究機構，使得這一細胞系成為了研究細胞生物學(xué)的基本工具之一。后來(lái)又衍生出CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHO-K1SV等等。

工業(yè)化生產(chǎn)適用CHO細胞具有以下優(yōu)勢。CHO細胞具有與人類(lèi)相似的翻譯后修飾能力，表達的蛋白生物學(xué)活性更加接近天然蛋白，具有生物學(xué)活性；倉鼠染色體數較少，CHO細胞具有清晰的歷史背景和監管機構的認可，更易于藥物生產(chǎn)申報；CHO細胞是一種成纖維細胞，屬于非分泌型細胞，它自身很少分泌CHO細胞自身內源蛋白，因此有利于下游工藝的純化；CHO細胞對外源重組基因有高效擴增和表達能力，并且可過(guò)表達目的基因穩定表達在宿主細胞內，易于放大培養，并懸浮達到高密度培養，目前隨著(zhù)表達工藝的優(yōu)化，蛋白表達量已可超過(guò)10g/L的高表達量，有利于大規模生產(chǎn)。

但是盡管如此，CHO細胞表達系統生產(chǎn)生物藥還面臨著(zhù)一些挑戰。比如重組CHO細胞上游構建與下游分離純化存在脫節的問(wèn)題，構建時(shí)一般著(zhù)重考慮目的基因的表達，而忽視了下游工藝純化的環(huán)節；CHO細胞表達的糖基化修飾蛋白不穩定，不易純化的難題也需要進(jìn)一步攻克；生產(chǎn)系統自動(dòng)化程度較低，工藝周期相對較長(cháng)，生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題。對于CHO細胞未來(lái)相關(guān)發(fā)展，還具有很大的改進(jìn)空間，無(wú)論是從表達體系培養基的完善，還是適用基因編輯技術(shù)對CHO細胞自身基因的改善，也希望學(xué)術(shù)及工藝界早日克服瓶頸，降低人類(lèi)研發(fā)及用藥成本。

真核生物系統有著(zhù)獨特的翻譯后修飾是原核系統無(wú)法替代的，但其工藝及生產(chǎn)成本的相對復雜是人們必須要面對的問(wèn)題，對于醫藥明星代表CHO細胞表達系統，相信未來(lái)人們也會(huì )對此不斷進(jìn)行完善。

參考文獻

[1] 張逸馳,李媛媛.昆蟲(chóng)細胞-桿狀病毒表達系統的研究進(jìn)展[J].中國生物制品學(xué)雜志,2020,33(12):1454-1459.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.003232.

[2] 梁璐琪.昆蟲(chóng)桿狀病毒表達系統研究進(jìn)展及其在疫苗中的應用[J].畜禽業(yè),2014(10):42-43.DOI:10.19567/j.cnki.1008-0414.2014.10.030.