近些年隨著(zhù)生物藥的不斷發(fā)展，生物藥的生物學(xué)活性分析必不可少，而有些藥物即使檢測到了結合活性，卻沒(méi)有功能活性，這就需要一個(gè)靠譜的檢測手段能反應真實(shí)的生物學(xué)活性情況。報告基因測定法通過(guò)模擬體內真實(shí)的信號通路與藥物作用機制來(lái)預測生物學(xué)活性水平，準確度高、精密度高，因此在表征和質(zhì)量控制中得到越來(lái)越多的認可和應用。
目前各種抗體、細胞因子、激素等生物藥均有采用報告基因法以測定其生物活性的報道，具體見(jiàn)表1。
表1. 報告基因法在生物藥活性檢測領(lǐng)域的應用[1]
概述
報告基因法( Reporter gene assays, RGAs) ，是指先將報告基因融合到宿主細胞中，然后通過(guò)外部刺激產(chǎn)生信號，在調控序列控制下，誘導報告基因表達相應產(chǎn)物，通過(guò)檢測表達產(chǎn)物的信號，可以直觀(guān)呈現細胞內與基因有關(guān)的信號級聯(lián)的方法。常見(jiàn)的報告基因有熒光素酶（LUC）、氯霉素轉乙酰酶（CAT）、綠色熒光蛋白（GFP）、β-內酰胺酶（LAC）、β-半乳糖苷酶（GAL）等[2]。與其他報告基因相比，螢光素酶具有以下優(yōu)勢：①非放射性；②分析方法簡(jiǎn)單，靈敏度高；③背景低：哺乳動(dòng)物無(wú)內源性熒光素酶表達，而且在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景熒光 [3]；④高效，通量大，檢測快速；⑤ 市場(chǎng)有多種商品化螢光素酶檢測系統可選，這也是熒光素（Luciferase） 報告基因系統的一個(gè)重大優(yōu)勢所在。
熒光素酶報告基因以熒光素(Luciferin)為底物來(lái)檢測熒光素酶(Luciferase)的活性。一般，熒光素檢測試劑盒中含有熒光素和細胞裂解液，細胞裂解后會(huì )釋放出熒光素酶，催化熒光素發(fā)出穩定的生物熒光(Bioluminescence)，然后通過(guò)酶標儀等熒光測定儀檢測到。熒光素酶的種類(lèi)繁多，但目前常用的主要是螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase，FLUC）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，RLUC）[4]。
報告基因系統構建方法
報告基因法能檢測轉錄因子與目的基因表達調節序列 （如增強子、啟動(dòng)子）之間的相互作用，轉錄因子是一種蛋白質(zhì)，通過(guò)識別特定的DNA序列來(lái)控制轉錄，指導基因表達[5]。例如CRE-Luci-293細胞株，CRE是cAMP反應原件（cAMP Response Elements），也是轉錄因子 CREB（CRE 結合蛋白）識別的DNA結合序列。CREB磷酸化后結合到CRE，啟動(dòng)Luciferase報告基因的表達。其中，CREB是轉錄因子，它的存在能刺激基因轉錄，所以又被稱(chēng)為轉錄增強因子[6]。
該報告系統該如何構建呢？首先，構建一個(gè)報告基因質(zhì)粒，將報告基因序列（熒光素酶表達序列）插入到基因表達調節序列后面；然后，將報告基因質(zhì)粒與目的基因表達質(zhì)粒共轉染HEK293T細胞或其它細胞系[7，8]。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì )表達。
信號通路
Luciferase報告基因的信號通路比較復雜，如圖1所所示，以GLP-1R 為例，GLP-1R 屬于G蛋白偶聯(lián)受體 B 簇亞族(B1) 的一員，是典型的一個(gè)七次跨膜蛋白，在胞內與異源三聚體G蛋白偶聯(lián)來(lái)傳遞胞外信號。當GLP1與GLP-1R結合，并且被活化后，G蛋白α亞基與β、γ亞基解離，進(jìn)而啟動(dòng)下游第二信使途徑級聯(lián)，最終通過(guò)各種反應元件進(jìn)行基因轉錄[9]。GLP1R被激活后，與G蛋白結合，形成GLP1R-G蛋白信號復合物，再與腺苷酸環(huán)化酶（AC蛋白）相互作用，誘導第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP,環(huán)腺苷3'，5'-單磷酸）的產(chǎn)生和積累。隨后，cAMP激活蛋白激酶A（PKA），活化的PKA又進(jìn)一步使CRE結合蛋白CREB磷酸化，活化后的 CREB與CRE序列結合，導致熒光素酶基因轉錄率升高[4，6]，進(jìn)而誘導報告基因Luciferase的表達。該熒光信號值的高低和GLP-1濃度或活性成正比。
圖1. 胰島 β 細胞中 GLP-1R 調控的信號通路[10]
雙熒光素酶報告基因系統（Dual-Luciferase reporter assay）
在進(jìn)行熒光素酶報告基因實(shí)驗時(shí)，細胞生長(cháng)狀態(tài)、細胞數目和轉染效率在每次實(shí)驗時(shí)不可避免會(huì )有細微差異，這多少會(huì )對結果的重復性帶來(lái)一些挑戰，為了最大程度上減少這些因素造成的影響，使得數據結果更加穩定準確，可以采用雙熒光素酶報告基因系統。
雙熒光素酶報告基因檢測系統就是細胞同時(shí)表達螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶兩種熒光素酶，兩者催化各自的底物產(chǎn)生生物熒光，具體的反應原理參見(jiàn)圖2。實(shí)驗設計以螢火蟲(chóng)螢光素酶為核心Reporter，海腎熒光素酶作為內參，減少實(shí)驗條件變化對檢測結果的干擾。構建質(zhì)粒時(shí)可以將螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶分別構建到兩個(gè)質(zhì)粒載體上，然后將兩種質(zhì)粒共轉染細胞；也可以將這兩種熒光素酶構建到同一個(gè)質(zhì)粒上，但是需要用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)兩種熒光素酶的表達[11]。質(zhì)粒構建成功后轉染細胞，檢測時(shí)分別添加相應的熒光素酶底物，用熒光測定儀檢測熒光強度。
圖2. （A）螢火蟲(chóng)熒光素酶催化反應原理；（B）海腎熒光素酶催化反應原理[11]
總結
隨著(zhù)生物藥檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng )新，生物學(xué)活性檢測方法也愈發(fā)紛繁多樣，而報告基因法因其操作便捷快速、通量高、靈敏度高、干擾少等優(yōu)勢被廣泛用于生物藥的生物學(xué)活性檢測。
報告基因法也收錄在《中國藥典》四部中：第3523條報告基因法為Ⅰ型干擾素活性測定的標準方法之一，第3535條康伯西普生物學(xué)活性測定也采用報告基因法。因此，報告基因法應用前景十分廣闊。
參考文獻：
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