多肽合成的研究從誕生至今已經(jīng)走過(guò)一百多年的光輝歷程。

1902年，Emil Fischer首先開(kāi)始關(guān)注多肽合成，不過(guò)進(jìn)展緩慢。

1932年，Max Bergmann等人開(kāi)始使用芐氧羰基(Z)來(lái)保護α-氨基，多肽合成開(kāi)始有了一定的發(fā)展。

20世紀50年代，有機化學(xué)家們在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得了不少成績(jì)，因此也合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素、胰島素等，同時(shí)，這為后來(lái)的固相合成方法的出現提供了實(shí)驗和理論基礎。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法（SPPS），帶來(lái)了多肽有機合成上的一次革命，并因此獲得1984年的諾貝爾化學(xué)獎。1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基（Fmoc）用于保護α-氨基，迅速得到廣泛使用。同時(shí)，在固相合成樹(shù)脂、縮合試劑以及各種氨基酸正交保護基方面，也取得了豐碩的成果。伴隨著(zhù)多肽合成方法的不斷進(jìn)步，相應的縮合劑也是不斷迭代，本文就多肽縮合試劑的演化歷程，展開(kāi)簡(jiǎn)述。

01、基本原理

眾所周知，多肽合成的基本原理，主要采用活化羧基的方法與氨基反應形成酰胺鍵來(lái)完成肽鏈的延伸。已知的成酰胺的方法主要有鹵?；?、疊氮、酸酐和活化酯等。

其中鹵?；▓D1-1），由于“過(guò)度激活”容易產(chǎn)生許多副作用，包括構型的喪失，已經(jīng)較少使用。

圖1-1 鹵?；瘷C理

氨基酸?；B氮化物由于制備繁瑣，且疊氮化合物存在一定的爆炸危險性，已經(jīng)過(guò)時(shí)（圖1-2），不常用，不過(guò)氨基酸?；B氮化合物用于片段縮合的構建被認為是一種可以抑制消旋的策略。

圖1-2 疊氮化機理

酸酐，又分為對稱(chēng)酸酐（圖1-3）和混合酸酐：對稱(chēng)酸酐可以用0.5eq的DIC制備，缺點(diǎn)很明顯，就是反應性較弱，且對稱(chēng)酸酐不能直接在極性溶劑中制備；混合酸酐很少用在固相合成中。

圖1-3 酸酐

活化酯（圖1-4），常用的包括：通過(guò)DCC，DIC，EDC.HCl與HOXT制備，如下：

圖1-4 常用活化酯

也可以通過(guò)酯交換制備（圖1-5），例如：

圖1-5 其他活化酯

經(jīng)過(guò)化學(xué)家們不斷地探索和研究，如今的活化酯方法已經(jīng)成為多肽成酰胺的主流策略。下文將針對各種活化酯展開(kāi)進(jìn)一步的介紹。

02

2.1

《第一代縮合劑》

是以DCC、DIC、EDC為代表的碳二亞胺型縮合劑（圖2-1），缺點(diǎn)：此類(lèi)試劑縮合效率不高，易產(chǎn)生嚴重消旋（主要發(fā)生在路線(xiàn)C的過(guò)程中（圖2-2）。

圖2-1 DIC/DCC結構

圖2-2 碳二亞胺反應機理

 2.2

《第二代縮合劑》

是基于HOBt、HOAt等添加劑的出現（圖2-3）；它與碳二亞胺縮合劑、離子型縮合劑聯(lián)合使用，可有效抑制消旋、提升反應速率。

圖2-3 添加劑結構

其中，HOBt最常用的添加劑，性?xún)r(jià)比高；HOAT具有高活性和低消旋率的特點(diǎn)，可用于A(yíng)ib后氨基酸的偶聯(lián)；6-Cl-HOBt在反應性和價(jià)格方面，介于HOAt和HOBt之間。除此之外HOSu/NHS也可以用于生成穩定的羧基活化酯結構。

在工業(yè)應用中需要注意以下幾點(diǎn)：

a.碳二亞胺介導的偶聯(lián)反應，用DCM作溶劑較好，4~25℃；考慮到溶解性的問(wèn)題，可以加入適量DMF；

b.對于可能發(fā)生鏈間聚集的肽鏈/序列，推薦使用極性更強的溶劑來(lái)抑制二級結構的形成；

c.考慮到成本因素和實(shí)際反應結果，HOXT/DIC不局限于傳統的1:1當量比；

d.介于大規模投料時(shí)的放熱特性，活化時(shí)有必要控制在4℃（預冷）。

2.3

第三代縮合劑

是基于HOBt和HOAt衍生的鎓鹽類(lèi)縮合劑，主要分為磷鹽和脲鹽。相較前兩代，無(wú)論在反應活性，還是在產(chǎn)物收率、純度方面，性能都優(yōu)于其他類(lèi)型縮合劑，為目前科研中使用的主流多肽縮合劑，應用相對最廣泛。

磷鹽中，BOP由于反應副產(chǎn)物的致癌性已經(jīng)不常用；PyBOP/PyAOP（圖2-4）是不錯的替代，它可用作位阻較大的肽的消旋化抑制縮合試劑；PyClocK，由于Cl-HOBt的酸性比HOBt強，因此相應的活性酯比PyBOP或HBTU產(chǎn)生的活性酯活性更強。PyClocK可用于環(huán)化和片段縮合，也可提高Aib后氨基酸的縮合效率，不同于HBTU和HATU，PyClocK的過(guò)量投料不會(huì )導致縮合時(shí)氨基被胍基化封閉（胍基化副反應見(jiàn)下文）；缺點(diǎn)是價(jià)格高。

圖2-4 PyBOP/PyClock結構

在各種脲鹽中，最常用的是HBTU，通常加入HOBt來(lái)提高反應速度。反應機理如下（圖2-5）。

圖2-5 HBTU反應機理

HATU被認為是最優(yōu)異的縮合劑之一，它在促進(jìn)氨基酸的偶聯(lián)以及抑制消旋方面均表現出優(yōu)異的性能，與N -烷基胺偶聯(lián)時(shí)特別有效。

HCTU（圖2-6）作為 HATU 和 HBTU型脲鹽縮合劑之間的一種折中方案，具有良好的偶聯(lián)效率和抑制消旋性能。

圖2-6 HCTU/HBTU/TBTU結構

HBTU/HATU會(huì )產(chǎn)生的一個(gè)典型副反應就是氨基的胍基化，它會(huì )中止肽鏈延伸，這種情況可能發(fā)生在片段縮合中羧基本身活性不足或溶解性差導致的預活化緩慢、不充分，或者位阻導致的反應速率較慢，此時(shí)如果存在過(guò)量的脲鹽縮合劑就會(huì )與氨基發(fā)生胍基化（圖2-7），此時(shí)N端被封閉，分子量多98。

圖2-7 胍基化機理

針對胍基化副反應的解決方法：

a.控制HATU當量，略小于A(yíng)A/片段當量；

b.溶解要徹底，充分的預活化（易消旋氨基酸如Phe，Cys，His等除外）；

c.使用 PyBOP或 PyAOP 代替作為首尾環(huán)化和肽片段的縮合劑。

2.4

第四代縮合劑

是基于Oxyma添加劑及衍生的新型縮合劑                    

Oxyma在多肽合成中表現出了優(yōu)異的性能，是替代 HOBt 和其它縮合添加劑的理想選擇。其優(yōu)點(diǎn)是其衍生物原料廉價(jià)易得、合成方法簡(jiǎn)單、溶解性好、性質(zhì)穩定、處理簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物毒性小，有些甚至可以回收重復使用。有研究表明，在一系列實(shí)驗中，Oxyma/DIC組合均表現出了不亞于甚至優(yōu)于HOAt/DIC組合的能力。

由Oxyma衍生而來(lái)的COMU（圖2-8），堪稱(chēng)偶聯(lián)試劑家族中最強大的代表。

它被認為是比HATU還要優(yōu)異的強力縮合劑，溶解度比HATU和HBTU高，不易爆炸，低過(guò)敏原性。COMU的副產(chǎn)物（如相應的尿素）具有很強的水溶性，COMU在DMF中可以制備比HBTU和HATU濃約4倍的溶液，直接影響偶聯(lián)效率，甚至不需使用多余的堿，不需要酸預活化，而苯并三唑類(lèi)似物需要一定的預活化時(shí)間。當然它的缺點(diǎn)也很明顯：DMF溶液中，穩定性遠不如其他試劑TOTU、HBTU和HATU等，可用于微波自動(dòng)合成，但不適用于一般的自動(dòng)合成，不適合緩慢偶聯(lián)；環(huán)化/片段縮合時(shí)，會(huì )導致N端胍基化，另外成本也較高。

類(lèi)似的縮合劑PyOxim（圖2-9），其偶聯(lián)反應效率優(yōu)于HATU和PyBOP，與COMU相當。它在DMF中有很好的溶解性，在溶液中也相對穩定，它不會(huì )引起鏈終止的副反應，具有低爆性、低致敏性。

2.5

其他縮合劑

如DEPBT、DMTMM、MSNT（圖2-10）等，也可應用于多肽合成，且在某些方面具有優(yōu)越的性能，不過(guò)價(jià)格也相對高一些。

圖2-10 DEPBT/DMTMM/MSNT結構

03

由于酰鹵化和疊氮化的極端反應活性或危險性，通常在肽合成中很少使用。預成型酯被考慮用于特殊應用，其價(jià)格較高。到目前為止，在肽鍵形成中，原位活化酯策略(通過(guò)使用碳二亞胺或單獨的偶聯(lián)試劑)仍占主導地位。新型添加劑Oxyma及其衍生縮合劑在肽合成中表現優(yōu)異，在工業(yè)生產(chǎn)中應用的越來(lái)越普遍。

然而針對不同的序列，或者同一序列的不同合成方式，縮合劑的使用也是根據具體情況而定的。例如針對Lily新上市的雙靶多肽Tirzepatide，報道的一種公斤級的生產(chǎn)方式（圖3-1），是采用了固液結合的方式進(jìn)行，其中片段間縮合時(shí)，為了提高反應效率就使用了活性較高的PyOxim和HATU。

圖3-1 Tirzepatide生產(chǎn)工藝路線(xiàn)

多肽合成的偶聯(lián)策略并無(wú)定式，是需要針對相應序列多次工藝路線(xiàn)的摸索或優(yōu)化后逐步形成的，這中間涉及成本、合成方式（LPPS或SPPS或LPPS+SPPS）、縮合劑（用法、用量）、氨基酸的側鏈基團、溫度的控制（脫保護，活化等）、洗滌/純化方式等因素。

綜上所述，隨著(zhù)縮合試劑和實(shí)驗條件的不斷改進(jìn)，化學(xué)家們和多肽藥物研究者們可以更方便地制備幾乎任何所需的肽。這也必將極大地促進(jìn)多肽和擬肽物作為治療相關(guān)疾病的藥物的發(fā)展。

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注：本文封面圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )