多肽藥物具有成藥性強、活性高、特異性好、毒性反應相對較弱、不易蓄積、藥物交叉反應少等特點(diǎn)。截至目前，全世界范圍內已有100多種多肽新藥獲批上市，用于治療糖尿病、癌癥、骨質(zhì)疏松、多發(fā)性硬化、HIV感染和慢性疼痛等各類(lèi)疾?。ㄒ?jiàn)圖1）。此外還有150多種多肽藥物處于臨床研究階段，400~600多種多肽藥物處于臨床前開(kāi)發(fā)階段。

圖1 已批準的和處于臨床研究階段的多肽藥物適應癥分布

據相關(guān)機構預測，至2025年全球多肽藥物的市場(chǎng)規?？蛇_960億美元，年復合增長(cháng)率約8%。，高于全球藥品市場(chǎng)的平均增長(cháng)率。多肽制藥領(lǐng)域已出現了多個(gè) “超級重磅炸彈”藥物，禮來(lái)制藥開(kāi)發(fā)的度拉糖肽（Dulaglytide）2022年銷(xiāo)售額高達75億美元，諾和諾德公司的司美格魯肽(Semaglutide)和利拉魯肽（Liraglutide）銷(xiāo)售額也分別達到109億美元、19億美元。2022年5月，禮來(lái)制藥開(kāi)發(fā)的2型糖尿病治療多肽藥物替西帕肽（Tirzepatide，商品名為Mounjaro，化學(xué)結構見(jiàn)圖2）被FDA批準上市，鑒于其在治療肥胖癥/超重的全球III期臨床試驗中表現出的優(yōu)異減重效果及減肥領(lǐng)域的巨大市場(chǎng)空間，有機構預測其2030前的峰值銷(xiāo)售額可達520億美元，成為有史以來(lái)最暢銷(xiāo)的藥物。隨著(zhù)藥物設計、虛擬篩選、高通量合成、結構修飾、制劑工藝等技術(shù)的不斷完善，多肽制藥已經(jīng)成為創(chuàng )新藥開(kāi)發(fā)新的熱點(diǎn)。

圖2 Tirzepatide的化學(xué)結構

01、多肽藥物的結構確證

對于多肽藥物，除了使用常規的技術(shù)手段如質(zhì)譜(Mass Spectrometry)、紅外(Infrared spectrometry)、核磁（Neuclear Magnetic Resonance）等對其結構進(jìn)行確證外，還需借助其它特殊的技術(shù)才能完成結構的有效確證。隨著(zhù)越來(lái)越多的多肽藥物被批準上市，國內外藥品監管機構對于多肽藥物結構確證相關(guān)法規和指導原則的要求也趨于嚴格。藥品研發(fā)企業(yè)在開(kāi)展產(chǎn)品研制和注冊申報過(guò)程中，應對結構確證相關(guān)國內外法規和指導原則的要求進(jìn)行深入理解，結合新藥開(kāi)發(fā)不同階段的不同要求，適時(shí)開(kāi)展適當的結構確證研究，做到有的放矢，既要避免研究不充分、不全面導致的審評發(fā)補風(fēng)險，又要避免過(guò)度研究導致企業(yè)研發(fā)成本不必要的增加。

02、多肽藥物結構確證研究的國內外申報注冊法規要求

2.1國外法規要求

2.1.1FDA相關(guān)法規

美國FDA于1994年發(fā)布了全世界第一個(gè)關(guān)于合成多肽藥物藥學(xué)研究的指導原則《Guidance for Industry for Submission of Chemistry, Manufacturing, and Controls Information for Synthetic Peptide Substances》，該指導原則首次對合成多肽藥物申報注冊時(shí)結構確證方面的研究提出了具體要求。

合成多肽藥物的結構確證至少應包括氨基酸組成分析(Amino acidanalysis)、質(zhì)譜分析(Mass Spectrometry)及氨基酸序列分析（Peptide sequencing）。氨基酸組成分析可證明該多肽的氨基酸組成是否正確?；诙喾N技術(shù)的質(zhì)譜，如快原子轟擊、電噴霧、場(chǎng)解吸、激光解吸等可提供化合物的相對分子質(zhì)量及序列信息，同時(shí)也可以說(shuō)明產(chǎn)品中有無(wú)相關(guān)合成雜質(zhì)。Edman降解能用于測定多肽的序列，如果N端被保護，則在Edman降解分析前應用適當的方法將N端保護基去掉。如果C端結構的改變，如酰胺化是由合成樹(shù)脂的修飾引起的，則在多肽定性時(shí)，對此可不要求；

如果多肽含有20個(gè)以上的氨基酸殘基，則需提供肽圖(Peptide Mapping)。各片段肽應分離出來(lái)并用質(zhì)譜或序列分析進(jìn)行定性研究；

當在合成過(guò)程中使用了非天然氨基酸（即20個(gè)天然氨基酸以外的氨基酸）時(shí)，則應提供這些氨基酸（用于氨基酸分析）及其衍生物（用于序列分析）的色譜行為，以證明這些氨基酸存在于合成多肽中；

當多肽結構中存在二硫鍵時(shí)，應與適當的還原劑如二硫蘇糖醇反應?所生成的游離巰基可用適當試劑（如Ellman’s試劑）來(lái)檢測。如果多肽中存在兩個(gè)或更多的二硫鍵，還應確定這些二硫鍵的正確連接點(diǎn)；

多肽的化學(xué)結構可用氫核磁共振1H-NMR及碳核磁共振譜13C-NMR進(jìn)一步證實(shí)。其它用于原料藥的結構確證方法均應詳細說(shuō)明【例如圓二色譜Circular dichroism)及熒光光(Fluorescence spectroscopy)】。

對于多肽體外診斷試劑盒，應證明多肽的側鏈上已無(wú)保護基或確證該保護基的存在。更重要的是還應證明多個(gè)抗原決定簇的存在。

2.1.2 USP相關(guān)要求

 自1994年至今，美國FDA一直未對《合成多肽藥物藥學(xué)研究指導原則》進(jìn)行更新，但美國另一藥品主管技術(shù)性機構美國藥典委員會(huì )（The United States Pharmacopieial Convention）在2023年發(fā)布的美國藥典通則中公開(kāi)了《合成多肽原料藥的質(zhì)量屬性》【(1503)Quality Attributes of Synthetic Peptide Drug Substances】這一指導性文件，該文件對多肽原料藥的結構確證內容提出了比較明確的要求（見(jiàn)表1）。

表1 USP合成多肽原料藥應開(kāi)展的結構確證研究?jì)热?/span>

2.1.3 EMA及ICH相關(guān)要求

歐洲藥品管理局（EMA）和人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調會(huì )（ICH）目前為止未專(zhuān)門(mén)發(fā)布過(guò)關(guān)于多肽藥物藥學(xué)研究相關(guān)（含原料藥結構確證）的指導原則。EMA僅在2013年發(fā)布的《Guideline on setting specifications for related impurities in antibiotics（抗生素類(lèi)藥物相關(guān)物質(zhì)限度制定指導原則）》中對多肽類(lèi)藥物的雜質(zhì)限度制定給出了具體要求。此外，EMA于2022.09.20發(fā)布了有關(guān)合成多肽藥物研發(fā)及生產(chǎn)指南概念文件《Concept Paper on the Establishment of a Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides》，預計未來(lái)正式發(fā)布的指導原則中會(huì )詳細闡述結構確證研究相關(guān)要求。

2.2國內法規政策要求

2.2.1 SFDA相關(guān)法規

我國SFDA于2005年發(fā)布的《化學(xué)藥物原料藥制備和結構確證研究技術(shù)指導原則》----“合成多肽藥物和多糖類(lèi)藥物“章節中，對合成多肽藥物結構確證方面的要求進(jìn)行了初步的闡述。

通過(guò)氨基酸組成分析、質(zhì)譜測定、序列分析以及肽圖測繪（含有 20 個(gè)

以上的氨基酸殘基藥物）等實(shí)驗可基本獲得合成多肽藥物的結構信息；

藥物結構中如有半胱氨酸，應明確其狀態(tài)（氧化態(tài)或還原態(tài)），對含有

多個(gè)半胱氨酸的多肽藥物，應明確二硫鍵的正確連接位點(diǎn)；

如各步中間體均進(jìn)行了質(zhì)譜測定，可根據相關(guān)中間體的結構信息，推測出

進(jìn)行反應的氨基酸的種類(lèi)；

質(zhì)譜是多肽藥物結構確證的重要手段，紫外、紅外、核磁共振、多種流

動(dòng)相 HPLC、比旋度測定等方法亦可對肽的結構確證提供幫助；

應對目標物的化學(xué)純度和對映體純度進(jìn)行研究。

2007年，SFDA首次發(fā)布了針對多肽藥物開(kāi)發(fā)的《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導原則》，并在2005年指導原則的基礎上對合成多肽藥物結構確證方面的要求進(jìn)行了更為詳細的闡述。

該指導原則的最大特點(diǎn)是按多肽藥物肽鏈的長(cháng)短分別提出了不同的結構確證要求（見(jiàn)表2）。

表2 SFDA多肽指導原則要求開(kāi)展的結構確證研究?jì)热?/strong>

2.2.2 NMPA相關(guān)法規

2023年2月，NMPA發(fā)布了《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導原則（試行）》，該指導性文件并未像2007版的指導原則按多肽化合物的長(cháng)短對結構確證相關(guān)內容進(jìn)行詳細論述，但明確指出了紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜在確證多肽化合物結構時(shí)存在的局限性，強調了多肽原料藥的一級結構確證中，必須對各氨基酸的連接順序進(jìn)行確證，對于具有氨基酸側鏈修飾的多肽以及存在兩個(gè)以上分子內環(huán)（如二硫鍵、酰胺鍵等）的環(huán)肽，應明確具體修飾位點(diǎn)、修飾物結構以及每個(gè)內環(huán)鍵的具體連接位點(diǎn)。此外，指導原則還重點(diǎn)強調了對于具有一定高級結構才能發(fā)揮其生物活性或緩釋作用的多肽創(chuàng )新藥物，應分析其高級結構（二級結構、三級結構）對體內生物活性的影響。

03、總結

新藥研發(fā)是一項關(guān)乎人民生命健康的神圣事業(yè)，國家必須出臺各種法規政策以規范和指導各制藥企業(yè)的研發(fā)行為。對于藥品研發(fā)企業(yè)，國內外藥品監管機構是第一客戶(hù)，患者是第二客戶(hù)（當然還有醫生和醫保局），只有研究?jì)热莘纤幤繁O管機構出臺的各項法規和審評要求，滿(mǎn)足第一客戶(hù)的需求，藥品才有機會(huì )給第二客戶(hù)使用，最終造?；颊?。因此，藥品研制和申報企業(yè)必須緊密跟蹤國內外發(fā)布的各類(lèi)藥品研發(fā)法規政策，熟悉監管要求，做到有的放矢，為企業(yè)新藥的成功申報提供保證。隨著(zhù)國內外關(guān)于多肽藥物研發(fā)結構確證相關(guān)法規的不斷完善，以及各類(lèi)新技術(shù)手段的出現，藥品監管機構對于多肽藥物結構確證的要求也在逐步提高，企業(yè)需要結合新藥開(kāi)發(fā)不同階段的不同要求，適時(shí)開(kāi)展適當的結構確證研究（見(jiàn)表3），避免研究不充分、不全面導致的審評發(fā)補風(fēng)險。

表3 多肽藥物注冊申報建議開(kāi)展的結構確證研究項目列表

參考文獻

[1]Guidance for Industry for Submission of Chemistry, Manufacturing, and Controls Information for Synthetic Peptide Substances.FDA,1994.

[2(1503)Quality Attributes of Synthetic Peptide Drug Substances.USP,2023.

[3]Guideline on setting specifications for related impurities in antibiotics.EMA,2013.

[4]Concept Paper on the Establishment of a Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides.EMA.2022

[5]化學(xué)藥物原料藥制備和結構確證研究技術(shù)指導原則.SFDA,2005.

[6]合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導原則.SFDA,2007.

[7]化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導原則(試行).NMPA,2023.

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