由于細胞和人體組織屏障的存在，導致許多有價(jià)值的藥物分子無(wú)法透過(guò)生物膜滲透進(jìn)入細胞和人體組織內部發(fā)揮功效。為了實(shí)現跨生物膜運輸，藥物通常具備高度親脂性(Lipophilic)或較小的化學(xué)結構。越來(lái)越多的生物活性大分子藥物如多肽、寡核苷酸、蛋白質(zhì)被轉化到了臨床研究階段，與小分子藥物相比，特異性更高、耐受性更好。然而，這些生物活性分子通常親水性(Hydrophilic)較高，生物膜滲透性(Membrane Permeability)差，無(wú)法進(jìn)入細胞內部與疾病靶點(diǎn)結合，大大限制了其治療價(jià)值。更具挑戰性的是在治療部分神經(jīng)退行性疾病時(shí)（如帕金森綜合癥），如何讓上述親水性藥物分子通過(guò)血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）進(jìn)入神經(jīng)系統組織實(shí)質(zhì)發(fā)揮藥效，是一個(gè)亟待解決的重大課題。隨著(zhù)細胞膜穿透肽(Cell Penetrating Peptides，CPPs)的發(fā)現，借助CPPs將各種生物活性物質(zhì)運送到難以進(jìn)入的組織細胞內部，與疾病相關(guān)靶點(diǎn)結合，從而達到治療疾病的目的。
細胞膜穿透肽(CPPs)是一類(lèi)由小于30個(gè)氨基酸殘基組成的、能夠直接穿過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞內部的多肽，也稱(chēng)為蛋白轉導域(Protein transduction domain，PTD)或膜轉運蛋白(Membranetransit protein, MTP)。CPPs不僅自身可以穿透細胞膜進(jìn)入細胞，而且能夠運載多種生物學(xué)活性物質(zhì)(如多肽、寡核苷酸、蛋白質(zhì)等大分子)進(jìn)入細胞內，并發(fā)揮相應的生物學(xué)活性和治療作用。其轉導效率高且不會(huì )造成細胞損傷，這一特性保證了各種大分子藥物細胞內的高效輸送。
Hossein D.et al.Trends in Pharmacological Sciences, April 2017, Vol. 38, No. 4,406
CPPs的發(fā)現及研究歷史
1988年Frankel等研究發(fā)現，HIV-1的轉錄（Transactivator of Transcription，TAT）蛋白可以經(jīng)細胞外內化作用進(jìn)入細胞內部，在病毒感染過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。Vivès等進(jìn)一步研究表明，負責介導TAT蛋白細胞內化過(guò)程的是TAT蛋白從第48位至60位的、含有13個(gè)氨基酸殘基的多肽序列。后續科學(xué)家先后發(fā)現了一系列具有細胞膜穿透能力的多肽，形成了CPPs肽家族，通常包括5-30個(gè)氨基酸，可以通過(guò)各種機制進(jìn)入細胞內部，且不與特定受體發(fā)生作用。自CPPs被發(fā)現以來(lái)，越來(lái)越多地被用于基礎研究（例如，作為各種類(lèi)型細胞最有效的轉染工具之一）以及翻譯研究；借助CPP可以增加難以進(jìn)入組織和細胞中的藥物濃度，從而提升治療效果；和抗菌素、抗炎藥以及抗腫瘤藥物等組合，用于各種類(lèi)型疾病的治療。
CPPs的分類(lèi)
對于CPPs的分類(lèi)，目前還沒(méi)有統一的方法，通?？梢园次锢砘瘜W(xué)性質(zhì)和來(lái)源進(jìn)行分類(lèi)。
2.1按物理性質(zhì)分類(lèi)
根據CPPs的物理化學(xué)性質(zhì)差異，可以分為陽(yáng)離子型(Cationic)、兩親型(Amphipathic)和疏水型(Hydrophobic)三類(lèi)。
⑴陽(yáng)離子型CPPs
包括在生理pH下具有高陽(yáng)性?xún)綦姾傻碾?，主要為富含精氨?Arg)和賴(lài)氨酸(Lys)的短肽鏈。此類(lèi)型的肽包括TAT衍生肽、滲透素、多聚精氨酸(PolyArg)和Diatos肽載體等。研究表明，與賴(lài)氨酸(Lys)相比，精氨酸殘基對細胞內化的貢獻更大。這是由于精氨酸的胍基與細胞膜中羧酸鹽、硫酸鹽、磷酸基團等含有負電荷的成份形成了雙配位氫鍵，從而在生理pH條件下導致CPPs的細胞內化。
⑵兩親型CPPs
兩親性CPPs序列中同時(shí)含有極性氨基酸和非極性氨基酸。除了在整個(gè)序列中分布的賴(lài)氨酸和精氨酸外，它們還富含疏水氨基酸殘基，例如纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和丙氨酸(Ala)。兩親性CPPs是通過(guò)共價(jià)結合疏水結構域獲得的嵌合肽，這對于有效靶向細胞膜非常重要，與核定位信號（NLS）關(guān)系密切。核定位信號一種基于賴(lài)氨酸、精氨酸或富含脯氨酸(Pro)的的短陽(yáng)離子肽，可通過(guò)核孔復合體(Nuclear pore complex)將肽藥物靶向運送到細胞核內部。
Jana V.et.al.Materials 2019,12,2671
⑶疏水型CPPs
疏水性CPPs序列中主要包含非極性氨基酸殘基，導致低凈電荷。疏水氨基酸序列對細胞膜疏水結構域的高親和力對于細胞內化過(guò)程至關(guān)重要。與陽(yáng)離子和兩親性CPPs相比，目前僅發(fā)現了少量的疏水CPPs，其細胞內化機制研究的也較少。
2.2按來(lái)源分類(lèi)
根據CPPs的來(lái)源不同，也可以分為三類(lèi)：
⑴天然存在的CPPs
一般是指天然蛋白質(zhì)的多肽區域，主要是將蛋白質(zhì)向細胞內轉運。例如 HIV-1的核轉錄激活蛋白TAT是最經(jīng)典的，也是最早發(fā)現的CPPs；
⑵人工合成的CPPs
天然存在的CPPs大多富含精氨酸或賴(lài)氨酸殘基，科學(xué)家們利用這一特性可合成多聚精氨酸或多聚賴(lài)氨酸類(lèi)CPPs，或者從應用的角度出發(fā)對天然的CPPs進(jìn)行修飾，合成一些穿膜效率更高的CPPs，例如Transportan、MPG、Pep-1等。其中，Pep-1是第一個(gè)獲批上市的CPP(商品名：Chariot);
⑶嵌合而成的CPPs
一般是指由兩條或以上的天然存在的序列融合而成的多肽，也屬于一類(lèi)人工合成的CPPs。
專(zhuān)業(yè)CPPs數據庫的統計分析結果表明，截至目前為止大約有1700個(gè)CPPs肽序列，其中絕大部分為線(xiàn)性肽序列（占94.5％）。和CPPs偶聯(lián)被用于生物醫學(xué)研究的主要偶聯(lián)物為熒光蛋白（占58.4%），然后是核酸（占16％）、蛋白質(zhì)（占9％）、納米顆粒（占7.8％）和多肽（占4.7％）。當前CPPs研究的方向主要集中在基于L-型氨基酸的合成肽方面（占84％），然后是氨基酸被修飾的CPPs（占11％），D-型氨基酸組成的CPPs約占3%，序列中同時(shí)含有L-型和D-型氨基酸的CPPs較少（約2%）。
Daniela K.et.al.Molecules 2017, 22, 1929
CPPs的透膜機制
盡管已開(kāi)展了大量研究，目前對于CPPs的確切透膜機制仍不是很明確。由于不同CPPs或CPPs偶聯(lián)物的物理化學(xué)性質(zhì)、分子大小和濃度差異較大，而這些特征對CPPs進(jìn)入細胞的效率有顯著(zhù)影響?？傮w上，CPPs的透膜過(guò)程可以歸為兩類(lèi)：非細胞質(zhì)膜依賴(lài)的直接穿透(Direct penetration)和能量依賴(lài)的內吞作用(Endocytosis)。
Hossein D.et al.Trends in Pharmacological Sciences, April 2017, Vol. 38, No. 4,406.
3.1直接穿膜機制
CPPs在直接穿透細胞膜時(shí)，不依賴(lài)能量，即使在非常低的溫度下也可以實(shí)現，甚至在存在內吞抑制劑的情況下也可以發(fā)生。有研究者認為CPPs首先聚積在細胞膜磷脂雙層的外部，誘導膜變形并形成瞬態(tài)環(huán)形(Toroidal pores）或桶形孔狀通道(Barrel-stave pores)。另外，針對陽(yáng)離子型CPPs的細胞攝取研究表明，在較高pH值條件下，細胞膜上的脂肪酸與細胞外CPPs的胍基結合，再通過(guò)瞬態(tài)環(huán)形孔介導其在質(zhì)膜上轉運。在與pH值較低的細胞質(zhì)接觸時(shí)，細胞膜脂肪酸將CPPs釋放到細胞中，瞬態(tài)孔關(guān)閉，實(shí)現CPPs的跨膜運輸。
3.2內吞機制
盡管直接滲透機制被首先提出用于解釋CPPs的透膜過(guò)程，但后續大量的研究表明，許多CPPs和CPP s偶聯(lián)物主要是通過(guò)內吞機制實(shí)現跨膜運輸。內吞作用是在細胞中自然發(fā)生的、依賴(lài)能量的過(guò)程。這一機制可能涉及幾種不同的途徑，這些途徑可以分類(lèi)為大胞飲作用(Macropinocytosis)、網(wǎng)格蛋白(Clathrin)或膜內陷素(Caveolin)介導的內吞作用、網(wǎng)格蛋白或膜內陷素獨立內吞作用。何種途徑占據主導主要取決于CPPs偶聯(lián)物的結構大小和物理化學(xué)性質(zhì)。雖然CPPs可以通過(guò)非內吞機制直接進(jìn)入細胞質(zhì)中，但有研究表明，在內吞作用期間，CPPs仍然被困在囊泡(Endocytic vesicles)中。因此，在CPPs和CPPs偶聯(lián)物發(fā)生內吞之后，必須從囊泡中進(jìn)入到細胞質(zhì)溶液，從而避免被溶酶體降解，最終到達作用靶點(diǎn)發(fā)揮其生物學(xué)活性。逃離內吞囊泡似乎是功能大分子完成有效細胞內遞送的主要限制因素。
CPPs從內吞囊泡逃逸的確切機制仍然不清楚，盡管有些假說(shuō)已被提出用于解釋此過(guò)程。例如一種觀(guān)點(diǎn)認為，CPPs的正電荷可以與內吞囊泡的負電荷成分相互作用，這種結合會(huì )導致囊泡的破裂和內含物的釋放。另一種假說(shuō)認為，內吞囊泡內外pH差異導致CPPs與膜的相互作用，最終使囊泡破裂。還有一種觀(guān)點(diǎn)認為，隨著(zhù)囊泡內容物的濃度升高，囊泡也會(huì )自然發(fā)生破裂，使CPPs逃逸。
目前，已經(jīng)研究出了各種策略以改善CPPs偶聯(lián)物的囊泡逃逸效率。其中一種方法是在CPPs中引入對pH敏感的肽序列，該pH敏感結構域在囊泡的酸性pH下破壞了膜的穩定，從而促進(jìn)了CPPs從囊泡中逃逸。還有一種方法是在CPPs中插入富含組氨酸的序列，在囊泡pH條件下吸附質(zhì)子，導致囊泡因滲透壓增加而破裂，稱(chēng)為質(zhì)子海綿效應(Proton-sponge effect)。
CPPs的臨床應用
過(guò)去幾十年中，對各種CPPs衍生療法的臨床前和臨床研究結果揭示了其潛在的巨大臨床應用價(jià)值。AVI4658是Sarepta Therapeutics開(kāi)發(fā)的CPPs-PMO（Phosphorodiamidate morpholino oligomers）衍生藥物，用于杜氏肌營(yíng)養不良(Duchenne muscular dystrophy)的治療，該藥已完成了III期臨床研究，于2020年被FDA批準上市；Auris Medical開(kāi)發(fā)的CPPs衍生藥物AM-111可謂命途多舛，其已于2018年完成的III臨床研究，因試驗結果未達到主要研究終點(diǎn)，導致開(kāi)發(fā)終止；OMO-103是Peptomyc S.L開(kāi)發(fā)的基于CPPs的非小細胞肺癌(NSCLC)治療用藥，目前已被批準開(kāi)展I/II期臨床研究；此外，還有多家制藥公司開(kāi)發(fā)的CPPs偶聯(lián)藥物進(jìn)入到了臨床研究階段。
*:臨床進(jìn)展數據來(lái)源于藥融云數據庫和ClinicalTrials.gov網(wǎng)站。
CPPs臨床應用的局限性及優(yōu)化措施
盡管已有大量臨床前和臨床試驗數據證明了CPPs在跨細胞和組織屏障中運輸各類(lèi)藥物分子的能力，但要達到大規模臨床應用還需要一系列問(wèn)題需要解決：
⑴細胞、組織及器官的特異性較低；
⑵CPPs的細胞攝取機制還未研究清楚，增加了偶聯(lián)物引起的毒副作用風(fēng)險；
⑶盡管CPPs在由細胞外運輸進(jìn)入細胞的過(guò)程5~30min內就可以完成，但部分CPPs在此過(guò)程中還是容易被蛋白酶水解；
⑷將質(zhì)粒DNA轉運至細胞內仍然有相當大的挑戰。
基于以上分析， CPPs衍生藥物如果要得到較好的臨床應用，需要在以下多個(gè)方面開(kāi)展更為深入的研究：
⑴對細胞攝取機制深入研究，探索不同CPPs和細胞類(lèi)型、偶聯(lián)物性質(zhì)之間的關(guān)系，利用這些參數對最佳組合條件進(jìn)行理論預測；
⑵開(kāi)發(fā)有效的定位序列，將穿膜肽和定位肽融合得到“雙功能CPPs”，提高CPPs的細胞和組織特異性；
⑶優(yōu)化CPPs跨膜運輸質(zhì)粒DNA的效率，發(fā)掘CPPs在基因療法中的應用潛力；
⑷將CPPs嵌合至多功能聚合物或納米脂質(zhì)體載體中，提高偶聯(lián)物運輸的選擇性、效率、能力，尤其是進(jìn)入癌細胞的能力；
⑸使用熒光標記的CPPs或納米載體，提高對腫瘤疾病發(fā)生和轉移的診斷和研究效率；
⑹將CPPs與抗體、酶及其它大的功能蛋白偶聯(lián)并運送至細胞內，開(kāi)發(fā)更加令人振奮的治療方法。
小結和展望
自1988年從HIV-1轉錄蛋白中發(fā)現了CPPs以來(lái)，過(guò)去數十年，相關(guān)研究初步揭示了其跨細胞膜運輸機制的神秘面紗。CPPs是新藥研究和開(kāi)發(fā)中一種非常有用的工具，可以攜帶多種不同大小和性質(zhì)的生物活性物質(zhì)進(jìn)入細胞，包括小分子化合物、染料、多肽、肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA、siRNA、脂質(zhì)體、噬菌體顆粒等，這一性質(zhì)為其成為靶向藥物的良好載體提供了可能。大量基于CPPs衍生物療法的臨床前和臨床研究結果展示了其在腫瘤、心腦血管、疼痛、神經(jīng)系統等疾病治療方面巨大的臨床應用價(jià)值。雖然在細胞特異性、細胞轉導效率等方面還存在一定的局限性，但和其它新興治療手段的發(fā)展歷史類(lèi)似，隨著(zhù)功效機制逐漸闡明和技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，相信基于CPPs衍生藥物的治療技術(shù)一定會(huì )大放異彩，為大量新藥的設計與開(kāi)發(fā)提供更多的思路和選擇。
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作者簡(jiǎn)介：
郭超，麥科奧特原料藥部高級經(jīng)理，負責麥科奧特蘇州原料藥部多肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)相關(guān)工作。
麥科奧特原創(chuàng )文章，轉載請聯(lián)系后臺