# 摘要#

本文對藥物研發(fā)過(guò)程中小分子化合物的結構確證工作進(jìn)行梳理和概括。

1小分子化合物進(jìn)行結構確證的一般順序

小分子化合物一般是通過(guò)定向合成、天然產(chǎn)物提取、發(fā)酵提取或半制備等方式制備得到。

首先需要通過(guò)定向合成、天然產(chǎn)物提取、發(fā)酵提取或半制備等方式制備得到目標產(chǎn)品，通過(guò)液相或氣相等檢測手段評估純度（原料藥純度通?！?9.0%）后，主要通過(guò)核磁共振氫譜（1H-NMR）、光譜及常規質(zhì)譜（MS）等方法，基于合成機理推斷平面結構；如合成機理不明確，采用提取方式獲得，或氫譜及質(zhì)譜等常規方法對化合物結構判斷的信息作用不大，則需要投入更多確證方法來(lái)輔助結構判斷，如借助碳譜（13C-NMR），二維核磁等來(lái)確證；在解析得到平面結構后，如判斷存在立體構型，應采用針對立體結構相應的研究手段，如NOESY、圓二色譜（CD）、單晶衍射等進(jìn)行確證。 

2小分子化合物進(jìn)行結構確證的研究手段

化合物結構初步確證后，按照相關(guān)指導原則，根據化合物類(lèi)別，對原料藥（新化學(xué)實(shí)體、已知化合物）、起始物料/中間體/雜質(zhì)（新化合物、已知化合物）結構確證的相關(guān)研究?jì)热菀?jiàn)表1。

備注說(shuō)明：

【1】根據國家局2018年發(fā)補的《新藥I期臨床試驗申請技術(shù)指南》，“在研發(fā)早期，應對樣品進(jìn)行初步結構確證，提交研究數據。完整的結構確證數據可在申報新藥上市時(shí)提交，包括一級結構、二級結構和高級結構等”

【2】如化合物為平面構型、不存在立體構型或多晶型，不需研究。

3結構確證總結

下文是對結構確證相關(guān)技術(shù)進(jìn)行的簡(jiǎn)單闡述，因結構解析是一門(mén)系統的學(xué)科，內容較多且精深，在此不做具體結構解析的陳述。

3.1 高分辨質(zhì)譜（HRMS）/質(zhì)譜（MS） 與常規質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜（HRMS）測得化合物的分子量可精確至小數點(diǎn)后第四位，常用于輔助確定化合物的分子質(zhì)量和和分子式，前提是通過(guò)核磁共振波譜已初步確定化合物結構。某些情況下，質(zhì)譜可以起到結構確證的關(guān)鍵作用。質(zhì)譜解析中還有一條大家都比較熟悉的“氮規則”：化合物分子不含氮或含偶數個(gè)氮原子時(shí)，其分子離子的質(zhì)量是偶數；化合物分子含奇數個(gè)氮原子時(shí)，其分子離子的質(zhì)量是奇數。

3.2 元素分析 元素分析對化合物中的各元素進(jìn)行含量測定，確定各元素的百分含量。針對各元素的特點(diǎn)，元素分析可選擇的方法較為多樣。碳、氫、氮元素檢測通常采用燃燒分解法；含鹵素或硫的化合物，采用氧瓶燃燒-滴定法（中國藥典2020年版四部通則0703）；金屬元素可采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-OES）；磷元素可采用酸分解-比色法等。測定完畢，比較測試結果與理論結果差值的大小，2005年發(fā)補的《化學(xué)藥物原料藥制備和結構確證研究技術(shù)指導原則》[1]規定“一般要求誤差不超過(guò)0.3％”，在實(shí)際遇到的一些案例中，會(huì )存在樣品容易吸潮或化合物含較多游離水，導致測試結果與理論結果誤差超過(guò)0.3%。在元素分析解析時(shí)，建議元素百分含量測定值扣除化合物的水分測定結果后，再與理論值比較誤差。

3.3 一維核磁共振波譜 取化合物2mg~10mg裝入核磁管，用合適的氘代試劑進(jìn)行溶解，用核磁共振波譜儀（頻率通常400M~800M）進(jìn)行檢測，內標物為四甲基硅烷（TMS）。1H的天然豐度較13C高很多，核磁測試時(shí)，兩者頻率通常是4倍關(guān)系，如氫譜（1H NMR）600M頻率對應碳譜（13C NMR）150M頻率；碳譜的響應較氫譜低，如果化合物量較少，在測試碳譜時(shí)，可通過(guò)積累掃描時(shí)長(cháng)增加碳譜的響應；分子量大的化合物較分子量小的化合物檢測用量要多。氘代試劑的選擇也非常關(guān)鍵，比較常見(jiàn)的氘代試劑有DMSO-d6，CDCl3，D2O，Methanol-d4，(CD3)2CO等。某些情況下，化合物的化學(xué)位移可能與氘代試劑（或氘代試劑中存在的水）在氫譜或碳譜中的化學(xué)位移重疊，影響結構確證，就需要更換氘代試劑進(jìn)行測定。指導原則[1]規定“對含有活潑氫的藥物必需進(jìn)行氘代實(shí)驗，以提供活潑氫的存在以及位置的信息?！?，選擇氘代試劑時(shí)，可采用重水交換來(lái)確認活潑氫的存在。同時(shí)，可結合二維1H-1H COSY譜進(jìn)行確認。

3.4 二維核磁共振波譜 二維核磁共振波譜是對平面結構進(jìn)行確證的關(guān)鍵。常用的為：

常用的為：HMBC（檢出1H異核多鍵相干技術(shù)）、HSQC（檢出1H異核單量子相干技術(shù)）、COSY（同核位移相關(guān)譜）、NOESY（核極化效應相關(guān)譜）。HMBC對推斷結構最為高效，它是看相隔2個(gè)或3個(gè)鍵氫原子與碳原子的遠程相關(guān)性；COSY（通常是1H-1HCOSY）看相鄰碳相連氫原子的相關(guān)性；HSQC看直接相連的碳氫相關(guān)性。通常通過(guò)這三種技術(shù)，即可初步確認化合物的平面結構。 

3.5 圓二色譜（CD） 圓二色譜（CD）是用于推斷非對稱(chēng)分子的構型和構象的一種旋光光譜，可用于確證化合物的絕對構型。

3.6 單晶X-射線(xiàn)衍射（XRSD）單晶X-射線(xiàn)衍射（XRSD）也是確定絕對構型的常用方法，可測定晶態(tài)分子的晶胞參數、晶系、空間群，可提供一個(gè)化合物在晶態(tài)中所具有原子的精確空間位置。該技術(shù)主要涉及單晶培養和檢測。晶體培養難度較大，需不斷嘗試且有足夠耐心。劍橋晶體數據中心（CCDC, the Cambridge Crystallographic Data Centre）自1965年起就從事晶體數據的收集、整理與計算機化工作，該中心發(fā)展的劍橋結構數據庫系統CSDS(CSDS，the Cambridge Structural Database System)是基于X光和中子衍射實(shí)驗唯一的小分子及金屬有機分子晶體的結構數據庫（網(wǎng)址：https://www.ccdc.cam.ac.uk/structures/），其中收錄了113萬(wàn)多化合物的晶體結構，每一個(gè)化合物均有自己的CCDC編號。

3.7 其他結構確證技術(shù)除上述結構確證方法外，還有很多其他的結構確證技術(shù)，如紅外、紫外、拉曼光譜、熱重分析（TG）、差示掃描量熱法（DSC）、旋光光譜等。

紅外光譜、熱重分析（TG）、差示掃描量熱法（DSC）、偏光顯微鏡法等對化合物晶型的判斷也可起到輔助作用。

某些化合物在固態(tài)時(shí)會(huì )表現出多晶型，多晶型會(huì )表現出紅外光譜的差異；通常，結構中微小的差別會(huì )使紅外光譜有很明顯的差別。

老藥組胺H2受體阻抗劑“西咪替丁”，參比制劑使用的原料藥為A晶型，其原料藥還存在另外三種晶型B、C、D，此外還有混合晶型。ABCD這四種晶型在紅外光譜中的吸收存在微小差異（見(jiàn)下表），根據這些差異，可采用紅外光譜來(lái)對A晶型產(chǎn)品進(jìn)行鑒別[2]。此外，DSC也顯示A晶型和B晶型在起始熔點(diǎn)和最高吸熱峰存在差異，可用于晶型鑒別[3]。

總結：本文對小分子化合物的結構確證方法進(jìn)行了初步匯總，實(shí)際工作中，因化合物結構和性質(zhì)差異，對結構確證技術(shù)方法的選擇和應用應仔細剖析后使用。

參考資料：

[1] 化學(xué)藥物原料藥制備和結構確證研究技術(shù)指導原則（2005年）

[2] Bela Hegedüs, Sándor Gorog. The polymorphismof cimetidine[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,1985, 3(4):303-313.

[3] 尹華, 楊臘虎, 等. 西咪替丁的晶型研究[J]. 藥物分析雜志, 2001, 21(1):39-42.